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1.      目的

制定標(biāo)準(zhǔn)化的志賀氏菌屬診斷血清操作程序，指導(dǎo)對(duì)志賀氏菌屬的檢測(cè)

2.      原理

用志賀氏菌屬的代表菌株制成滅活菌抗原分別或混合免疫家兔所得的血清，經(jīng)吸收出去非特異性凝集素后制成，通過(guò)凝集試驗(yàn)原理診斷各型志賀氏菌。

3.      試劑及實(shí)驗(yàn)設(shè)備

3.1   志賀氏菌屬診斷血清

3.2   試劑保存：2~8°C避光保存，防止凍結(jié)，在有效期內(nèi)使用。

3.3   實(shí)驗(yàn)設(shè)備：玻片、吸樣槍、接種環(huán)、水浴箱、玻璃管、血平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、電熱高溫接種滅菌器。

4.      程序步驟

4.1   將診斷血清于冰箱取出后平衡至室溫。

4.2   選擇符合志賀氏菌屬培養(yǎng)特性，并經(jīng)初步生化檢測(cè)符合志賀菌屬生物特性的疑似菌落。

4.3   菌群分析

將經(jīng)18~24h血平板上純培養(yǎng)的待檢菌，分別用志賀氏菌屬4種多價(jià)血清做玻片凝集試驗(yàn)，凝集陽(yáng)性時(shí)，再分別用群多價(jià)血清做玻片凝集試驗(yàn)，群多價(jià)血清凝集陽(yáng)性時(shí)，再分別與相應(yīng)的單價(jià)血清做玻片凝集試驗(yàn)，最終確定其血清分型。如果志賀氏菌屬4種多價(jià)血清做玻片凝集試驗(yàn)均為陰性，可能有以下3種可能性：①K抗原的存在，處理方法：取待檢菌的純菌落于生理鹽水中制成濃度約2麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海糜?/span>100°C水浴中煮沸30min，泠卻至室溫后再用診斷血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)；②非典型菌落，處理方法：通過(guò)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的傳代讓其恢復(fù)抗原性，再用診斷血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)；③診斷血清型以外的可送市或省CDC檢測(cè)。

4.4   玻片凝集試驗(yàn)法取18~24h血平板上純培養(yǎng)的待檢菌，用生理鹽水制成2麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海≡\斷血清20μL于潔凈玻片上，然后取20μL待檢菌懸液與血清混勻，輕輕搖動(dòng)玻片，1min內(nèi)呈現(xiàn)明顯凝集者為陽(yáng)性，呈均勻渾濁者為陰性，每次凝集試驗(yàn)均應(yīng)以生理鹽水作為陰性對(duì)照試驗(yàn)。若與福氏志賀氏菌單價(jià)血清呈現(xiàn)凝集可參照福氏志賀氏菌診斷抗原表（見附表）及生化特性做菌型診斷。

5.      質(zhì)量控制

志賀氏菌屬4種多價(jià)血清選擇福氏志賀氏菌屬為陽(yáng)性對(duì)照株；選擇大腸埃希菌ATCC25922為陰性對(duì)照菌株。同一批號(hào)每月進(jìn)行一次質(zhì)控試驗(yàn)，新批號(hào)試劑進(jìn)行質(zhì)控試驗(yàn)。

6.      質(zhì)量記錄

7.      參考文獻(xiàn)

[1]    盧錦漢主編.醫(yī)學(xué)生物制品學(xué).北京.人民衛(wèi)生出版社.1995

[2]    中國(guó)生物制品規(guī)程（2000年版）.北京.化學(xué)工業(yè)出版社.2000

附表：志賀氏菌屬國(guó)內(nèi)常見菌型診斷抗原表

 注：該文章由健侖生物研究人員以依據(jù)日本生研公司生產(chǎn)的志賀氏診斷血清實(shí)驗(yàn)編寫.