人胎球蛋白A檢測試劑盒
人胎球蛋白A檢測試劑盒（酶聯免疫法）
預期用途
此試劑盒可用于血清，血漿，細胞上清，組織提取物和尿液中人胎球蛋白A也稱之為α-2-HS糖蛋白的定量的檢測；血清或血漿中胎球蛋白A的檢測可作為某些癌癥及基因遺傳缺陷的血清蛋白診斷的輔助工具；此試劑盒僅供實驗室專業人士使用
簡介
胎球蛋白A也稱之為α-2-HS糖蛋白，是由兩個氨基末端抑制域和一個較小的羧基末端域組成的59 kDa 分子量的糖蛋白；由肝臟合成，分泌至血流，成年哺乳動物體內的濃度范圍在0.5-1.0g/L；嬰兒期的血清胎球蛋白A含量高，參與蛋白酶抑制活性，與鈣代謝和骨生成調節相關；累積于骨和牙齒內，作為生物學上非膠原骨蛋白的主要部分，研究表明，胎球蛋白A是循環中主要的鈣化抑制劑；干涉鈣鹽沉淀；近期研究顯示低水平胎球蛋白A的慢性腎臟衰竭患者與心血管病的高死亡率顯著相關；另一方面，糖尿病老年人血清胎球蛋白A含量比正常人高，這是獨立于胰島素抑制劑的其他標記物；另外，高胎球蛋白A水平還可作為心血管疾病的的危險標記物
實驗原理
此試劑盒可用于血清樣本中人胎球蛋白A的定量檢測；采用雙位點夾心法，羊抗人胎球蛋白A多抗結合人胎球蛋白A的不同位點
將含人胎球蛋白A的試驗標準品，質控品和預稀釋樣本加至包被了高度親和羊抗人胎球蛋白A多抗的微孔內，第一次孵育，包被抗體捕獲樣本中的人胎球蛋白A，未結合的蛋白洗板除去，然后加入HRP標記的抗人胎球蛋白A酶聯物加入至每孔，“夾心-人胎球蛋白A-HRP-標記的酶聯物”形成夾心，未結合的示蹤抗體通過洗板除去，結合于包被板上的HRP酶免物與底物液定時反應，然后在酶標儀上檢測；結合于包被胎球蛋白A上示蹤抗體酶活性與樣本中胎球蛋白A的含量直接相關，在點對點或三次回歸模式下以標準品的濃度比上OD值繪制標準曲線，樣本中的胎球蛋白A可直接從標準曲線上得到
試劑：準備與貯存
此試劑盒收到后立即貯存于2-8℃下，效期見試劑盒標簽；所有成分在2-8℃下可保存至有效期
使用前，所有試劑平衡至室溫，不同批次的試劑不能交換使用
包被板，96孔，包被了抗人胎球蛋白A抗體；微孔板固定于板架上，密封于含有干燥劑的鋁箔密封袋內；貯存于2-8℃至有效期
胎球蛋白A示蹤抗體，1瓶，0.6 ml，濃縮，HRP標記的抗人胎球蛋白A示蹤抗體溶于穩定的蛋白基質中；此試劑使用前需用示蹤劑抗體稀釋液進行稀釋；貯存于2-8℃至有效期
示蹤抗體稀釋液，1瓶，11ml，即用，Trizma鹽酸溶于緩沖液；根據實驗步驟用于示蹤抗體稀釋；貯存于2-8℃至有效期
試驗緩沖液，濃縮，1瓶，11ml，含牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽；建議使用前以1:10比例用雙蒸水稀釋（如11 ml濃縮+99 ml的雙蒸水）；貯存于2-8℃至有效期
洗滌液，濃縮，1瓶，20ml，30倍濃縮；試驗前需用580ml的雙蒸水稀釋，混勻；一旦稀釋，不含疊氮化物防腐劑的磷酸緩沖鹽洗滌液會含表面活性劑；稀釋的洗滌液在室溫下可保存至效期
HRP底物液；1瓶，12ml，含過氧化氫的TMB底物液；貯存于2-8℃至有效期
終止液，1瓶，12ml，0.5M硫酸，貯存于2-8℃至有效期
胎球蛋白A標準品，5瓶，含胎球蛋白A，不含疊氮化物防腐劑的液態牛血清基質；各標準品濃度見瓶子標簽；3次凍存周期使用后，所有標準品保存至-20℃或更低
胎球蛋白A質控，2瓶，含人胎球蛋白A，不含疊氮化物防腐劑的液態牛血清基質，各質控的精確濃度范圍見瓶子標簽，3次凍存周期使用后質控保存至-20℃或更低
安全注意事項
此試劑用于臨床參考實驗室，僅供醫生或實驗室專業人士體外診斷用
若試劑是有潛在感染風險的，試驗操作和處理時應戴手套
避免接觸含TMB，過氧化氫，硫酸的試劑，TM,B會刺激皮膚和粘膜，導致皮膚過敏反應；TMB還可能是致癌物質；皮膚接觸到硫酸會導致嚴重灼傷，不要接觸到眼睛，皮膚，衣服，不要吸入煙霧，一旦接觸，應立即用大量水沖洗至少15min
良好實驗室操作規范
實驗所需材料但試劑盒未提供
精確的單通道移液器，10-25-100-1000ul
適于100 ul的可重復用分液器
適于所有體積的一次性槍頭
一次性玻璃管或塑料管12x75mm或13x100mm
帶蓋的一次性塑料瓶；100-1000ml
鋁箔紙
雙蒸水或去離子水
塑料蓋板或聚乙烯薄膜
多通道洗滌瓶或全自動（半自動）洗板系統
酶標儀，450nm
樣本采集
人胎球蛋白A的檢測所需血清或血漿樣本量僅10 ul
個人在采樣前無需特殊準備，全血采集，室溫下立即凝集30min，然后離心分離出血清（850-1500
xg 10min）。全血采集3小時內需將血清從凝集中分離出來，轉移至另一干凈試管；血清樣本可保存在-20℃或更低，避免超過三次的凍融
建議采用24小時尿液來檢測尿液中的胎球蛋白A；采集第二天早晨的尿液，排除采樣前剛進行劇烈運動的，因腎功能不全導致多尿的；由利尿藥引起的人體內尿蛋白含量波動降低，可能與尿肌酸酐濃度相關；
細胞上清，組織提取物則需進行試驗樣本的倍比稀釋；多個平行樣檢測得到更精確的試驗結果
實驗步驟
患者樣本的準備
患者血清或血漿樣本在檢測前需用試驗緩沖液進行1:10000 的稀釋
以1A和1B 標記兩個試管（12x75 mm）
加1ml的試驗緩沖液至各試管（1A和1B）
加10 ul的患者血清至1A試管，混合（1:100）
從1A管內吸取10ul已稀釋的樣本至1B試管，混合（1:10000）
注意：建議采用精確/經校準的移液器，稀釋過程小心操作，得到更精確的結果；建議采用多通道（Combitip）12.5ml的Eppendorf可重復移液器加1ml的試驗緩沖液，而不用50ml的槍頭
患者尿液樣本的實驗前用試驗緩沖液1:100的稀釋
以1標記一試管（12x75 mm）
各管加1ml試驗緩沖液
加10ul患者尿液樣本至1管，混合（1:100）
注意：若所得結果中樣本濃度高于5個標準品中的最高標準品濃度，則尿液樣本需進一步稀釋（如1:500），然后重新檢測
試劑準備
試驗前將所有試劑平衡至室溫，不同批次的試劑不能混合使用
使用前，試驗緩沖液（濃縮）及洗滌液（濃縮）需進行稀釋，配制成工作液；詳情請見“試劑”部分
試驗操作
將實驗所需板條固定于板架上，標準品，質控品及未知樣本做雙孔檢測
試驗布局
|
ROW |
STRIP 1 |
STRIP 2 |
STRIP 3 |
|
A |
STD 1 |
STD 5 |
SAMPLE 2 |
|
B |
STD 1 |
STD 5 |
SAMPLE 2 |
|
C |
STD 2 |
C 1 |
SAMPLE 3 |
|
D |
STD 2 |
C 1 |
SAMPLE 3 |
|
E |
STD 3 |
C 2 |
|
|
F |
STD 3 |
C 2 |
|
|
G |
STD 4 |
SAMPLE 1 |
|
|
H |
STD 4 |
SAMPLE 1 |
|
加25 ul的標準品，質控品及預稀釋的1:10000樣本至相應孔內；注意：尿液樣本是1:100的稀釋
每孔加100 ul的試驗緩沖液
混勻，蓋板，避免暴露于陽光下
室溫下孵育2小時
示蹤抗體工作液的準備，示蹤抗體1:21的用示蹤抗體稀釋液稀釋；每條板需1ml的示蹤抗體稀釋液+50 ul的胎球蛋白A示蹤抗體
移去蓋板，棄去孔內反應液，每孔加350ul的洗滌工作液洗板5次，然后徹底吸出孔內液體，或可采用全自動洗板機
以上稀釋的示蹤抗體工作液加100 ul至各孔
蓋板，避免暴露于陽光下
室溫下孵育30min
移去蓋板，棄去孔內反應液，每孔加350ul的洗滌工作液洗板5次，然后徹底吸出孔內液體，或可采用全自動洗板機
每孔加100 ul的ELISA HRP 底物液
蓋板，避免暴露于陽光下
室溫下孵育20min
移去蓋板，每孔加100 ul的終止液，混勻
10min 內在450nm酶標儀上檢測吸收值
注意：為降低背景色，可以雙波長檢測，設置參考波長：595nm 或620 nm 或630nm
操作注意事項
建議所有標準品，質控品和未知樣本做雙孔檢測；各雙孔檢測的吸收均值用于數據處理，結果計算
將光敏試劑保持裝于原琥珀色瓶內
將剩余的包被板條放存在含干燥劑的密封袋內，避免受潮
操作嚴格，移液器經校準可確保試驗的可重復性
孵育時間或溫度也可能會影響試驗結果
避免微孔內產生氣泡，可能會導致結合率低，雙孔讀數變異系數高
使用前所有試劑都應徹底混勻，避免產生氣泡
結果說明
計算各雙孔吸收值均值
所有的吸收均值都減去標準品1（即0ng/ml）的吸收均值
在點對點或對數-對數坐標紙上以標準品的濃度為X軸，吸收均值為Y軸繪制標準曲線；或是采用數據處理軟件進行結果計算
質控品和樣本濃度（1:10000）可直接從標準曲線上讀取，若采用的是對數-對數或數據處理軟件計算則需用到對數轉換；樣本校正吸收值在濃度1ng/ml 和下一個最高標準品間的需通過公式計算：
|
未知樣本濃度= |
未知樣本吸收值 |
x 2nd 標準品濃度值 |
|
2nd 標準品吸光值 |
典型標準曲線
以下為典型示例的吸收值及標準曲線；此標準曲線不能用于其他實驗的計算
人胎球蛋白A分析靈敏度，零標準品20次重復試驗，95%置信區間，最后得5.0 ng/ml
線性
兩個人的血清樣本進行稀釋檢測，結果如下，ng/ml
|
# |
稀釋比例 |
檢測值 |
期望值 |
回收率% |
|
1 |
1:10,000 |
21.9 |
|
|
|
|
1:20,000 |
11.9 |
11.0 |
108 |
|
|
1:40,000 |
5.3 |
5.5 |
96 |
|
|
1:80,000 |
2.9 |
2.7 |
107 |
|
|
1:160,000 |
1.6 |
1.4 |
114 |
|
2 |
1:10,000 |
192 |
|
|
|
|
1:20,000 |
99.9 |
96 |
104 |
|
|
1:40,000 |
45.2 |
48 |
94 |
|
|
1:80,000 |
22.2 |
24 |
93 |
|
|
1:160,000 |
13.4 |
12 |
112 |
精密度
兩個樣本在一個試驗中做20次重復檢測，分析板內差異
|
胎球蛋白A均值(ng/mL) |
CV (%) |
|
33.6 |
5.5 |
|
121.1 |
4.8 |
兩個樣本雙孔檢測，做了12次檢測，分析板間差異
|
胎球蛋白A均值(ng/mL) |
CV (%) |
|
32.4 |
6.8 |
|
123.7 |
5.7 |
4. 回收率
兩位患者血清加不同量的人胎球蛋白A ，檢測，結果如下，ng/ml
|
# |
原始值 |
加入的量 |
檢測值 |
期望值 |
回收率% |
|
1 |
33.6 |
21 |
25.1 |
27.3 |
92 |
|
|
|
63 |
44.4 |
48.3 |
92 |
|
|
|
200 |
120.1 |
116.8 |
103 |
|
2 |
121.1 |
21 |
68.9 |
71.1 |
97 |
|
|
|
63 |
88.6 |
92.1 |
96 |
|
|
|
200 |
157.1 |
160.6 |
98 |
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