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為保證及時(shí)、科學(xué)地采集、運(yùn)送人粒細(xì)胞無(wú)形體病病例（包括疑似病例）及疫源地調(diào)查的各種類型標(biāo)本，規(guī)范人粒細(xì)胞無(wú)形體病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)程序，提高檢測(cè)質(zhì)量，為明確診斷或開展相關(guān)的科學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，特制定本方案。

一、樣本采集對(duì)象

（一） 人粒細(xì)胞無(wú)形體病病例（包括疑似病例，以下同）。

（二） 病例密切接觸者或其他健康人群。

（三） 疫源地可疑宿主動(dòng)物（野生動(dòng)物及狗、羊、牛等家畜）、媒介蜱。

二、標(biāo)本種類及采集方法

（一） 抗凝血。

常用EDTA抗凝管或枸櫞酸鹽抗凝管采集血液5ml，用于病原分離。應(yīng)盡可能在病人使用抗生素前進(jìn)行血液的采集。

（二）非抗凝血。

用無(wú)菌真空管，采集病例、健康人群及宿主動(dòng)物非抗凝血5ml，用于血清抗體及PCR檢測(cè)。采集后，應(yīng)及時(shí)分離血清，將血清、血球分別保存。急性期抗體及PCR檢測(cè)用血液采集盡可能在發(fā)病后1周內(nèi)，恢復(fù)期抗體檢測(cè)標(biāo)本采集至少間隔2-3周。如第2份血清在1個(gè)月之內(nèi)抗體升高不明顯的，應(yīng)建議間隔2-4周后采集第3份血液標(biāo)本。

（三）包涵體檢測(cè)血涂片的制備。

采集血液標(biāo)本后，制作厚血片，進(jìn)行紅細(xì)胞裂解處理等。

（四）媒介蜱標(biāo)本的采集。

采集動(dòng)物體表媒介蜱，用鑷子夾取，放入鋪墊有潮濕濾紙或紗布的青霉素小瓶或試管中，用紗布包緊瓶口以防止蜱爬出。實(shí)驗(yàn)室接到蜱標(biāo)本后，首先應(yīng)進(jìn)行種屬鑒定，然后按類別分組（1-5只蜱/組），采用75%酒精浸泡30min后，用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)沖洗3次。最后進(jìn)行分組研磨，研磨液用于提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

（五）有條件時(shí)，可采集活檢或尸檢標(biāo)本，冰凍、福爾馬林固定或石蠟包埋后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。具體方法參照病理實(shí)驗(yàn)室相關(guān)要求和衛(wèi)生部《傳染病人或疑似傳染病人尸體解剖查驗(yàn)規(guī)定》的相關(guān)要求。

三、標(biāo)本采集和保存注意事項(xiàng)

標(biāo)本采集應(yīng)符合無(wú)菌操作要求。抗凝血如不能立即床邊接種，應(yīng)置于4℃環(huán)境保存，避免冰凍（不超過(guò)2周）。非抗凝血應(yīng)及時(shí)進(jìn)行無(wú)菌分離血清，血清用于抗體檢測(cè)，血球部分研磨后提取DNA用于PCR檢測(cè)。如不能及時(shí)檢測(cè)，可暫置于－20℃環(huán)境保存。所有標(biāo)本應(yīng)置入大小適合、帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈的凍存管內(nèi)，擰緊管口。

標(biāo)本采集后，應(yīng)認(rèn)真填寫采樣登記表。

四、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

（一）包涵體的檢測(cè)。

1. 血片及白細(xì)胞涂片制備

采集的抗凝血標(biāo)本盡快用血球?qū)油蒲?，待干燥后冷丙酮固?/span>10min；或提取抗凝血中的白細(xì)胞并進(jìn)行涂片，待干燥后冷丙酮固定10min。

2. 染色

通常采用瑞氏（Wright）染色法、姬氏(Giemsa)染色法及瑞－姬混合染色法。有條件的實(shí)驗(yàn)室，可使用美國(guó)CDC推薦的染色方法。

3. 染液配置方法

（1）瑞－姬染液：取瑞氏染料和姬氏染料各0.5 g，以甲醇研溶，加甲醇500ml保存，每天搖勻１次，１周后可使用。
    （2）改良Mc Donald法瑞－姬染色劑：75 ml甘油（分析純）中加入磷酸鹽緩沖液（Na₂HPO₄ 1g和KH₂PO₄ 2g），以4 ml蒸餾水溶解，37 ℃水浴24 h溶解混勻，用濾紙過(guò)濾，保存于密封的棕色瓶中備用。上述甘油緩沖液1.5 ml加瑞－姬染色劑50 ml，混勻后備用。

4. 染色步驟

血推片或白細(xì)胞涂片分別以兩種染色劑染色2 min，再加蒸餾水作用5 min，用自來(lái)水沖洗。
    5. 結(jié)果觀察

中性粒細(xì)胞中可見桑葚狀包涵體（見圖1），并注意保存相關(guān)標(biāo)本，以便進(jìn)行復(fù)核。

（二）血清學(xué)檢測(cè)。

常用血清學(xué)方法為間接免疫熒光（IFA）法。采集急性期（發(fā)熱初期，一般發(fā)病1周內(nèi)）與恢復(fù)期（至少間隔2-3周）雙份血清。如恢復(fù)期血清抗體檢測(cè)陰性，應(yīng)建議醫(yī)生采集第3份血液樣本（間隔2-4周）。

1. 試劑 

使用國(guó)際推薦的、經(jīng)過(guò)ISO質(zhì)量認(rèn)證的產(chǎn)品。

2. 方法及操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

3. 結(jié)果解釋

IFA檢測(cè)結(jié)果解釋按說(shuō)明書進(jìn)行。

如果同時(shí)檢測(cè)雙份血清，IgG抗體4倍升高，則結(jié)果強(qiáng)烈支持嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體感染。如果急性期抗體升高，而恢復(fù)期沒有升高或輕微升高，則應(yīng)采集第3份血液樣本（間隔2-4周）進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。

（三）嗜粒細(xì)胞無(wú)形體核酸PCR檢測(cè)。

目前，國(guó)際推薦使用16S rRNA基因檢測(cè)方法，有條件的實(shí)驗(yàn)室，可進(jìn)一步選用熱休克蛋白基因groEL擴(kuò)增方法。

1. DNA提取

用急性期、未使用抗生素的EDTA抗凝血或非抗凝血血球部分、白細(xì)胞及蜱研磨液提取DNA。最后，以AE緩沖液50μl抽濾以提高回收的DNA濃度。如采用血液白細(xì)胞層提取DNA，可明顯提高陽(yáng)性檢出率。實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采集當(dāng)?shù)卣Ｈ搜和瑫r(shí)提取DNA，作為PCR的陰性對(duì)照。

2. PCR擴(kuò)增

（1）16S rRNA基因檢測(cè)：16S rRNA 高度保守，是PCR檢測(cè)最常用的擴(kuò)增靶基因，巢式PCR檢測(cè)可提高檢測(cè)靈敏度和特異度，采用屬特異及種特異引物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。PCR檢測(cè)應(yīng)分區(qū)進(jìn)行，避免污染。使用引物序列見表1。

表1  巢式PCR檢測(cè)無(wú)形體及埃立克體16S rRNA基因常用引物

引物名稱	序 列	片段長(zhǎng)度(bp)
Eh-out1(AF414399)	5’-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3’	653
Eh-out2(AF414399)	5’-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3’
Eh-gs1(AF414399)	5’-GTA ATA CT GTA TAA TCC CTG-3’	282
Eh-gs2(AF414399)	5’-GTA CCG TCA TTA TCT TCC CTA-3’
HGA1	5’-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG -3’	389
HGA2	5’-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3’

 

PCR反應(yīng)混合物的準(zhǔn)備按常規(guī)進(jìn)行。第一輪反應(yīng)采用外引物對(duì)Eh-out1和Eh-out2，DNA模板10μl（白細(xì)胞提取的DNA可適當(dāng)減少）。PCR反應(yīng)體系總體積為25μl或50μl（需要進(jìn)行PCR測(cè)序或克隆時(shí)，應(yīng)適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系），其它成分的濃度按常規(guī)進(jìn)行。反應(yīng)程序如下：

94℃  5min

40循環(huán)：94℃  45sec

        55℃  50sec

        72℃  1min

72℃  總延伸 5min

第二輪反應(yīng)使用2對(duì)引物分別進(jìn)行巢式PCR。2對(duì)引物分別是無(wú)形體屬及埃立克體屬通用內(nèi)引物（Eh-gs1、Eh-gs2）；以及HGA種特異性引物（HGA1及HGA2）。檢測(cè)樣本取第一輪產(chǎn)物1-2μl為模板，陽(yáng)性對(duì)照取0.5μl為模板。反應(yīng)程序同第一輪反應(yīng)。

（2）熱休克蛋白基因groEL擴(kuò)增

與groEL基因的應(yīng)用相比，16S rRNA基因的應(yīng)用更為廣泛，但groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性。因此，對(duì)于診斷及菌株的鑒定，groEL基因均具有重要意義。該基因擴(kuò)增使用巢式PCR，引物序列見表2。

表2  groEL基因擴(kuò)增常用引物   

引物名稱	序  列	退火溫度	片段長(zhǎng)度bp)
HS1	5’-TGG GCT GGT  A（A/C）TGA AAT	52℃	1431
HS6	5’-CCI CCI GGI ACI  A（C/T）ACC TTC
HS43	5’-AT（A/T）GC（A/T） AA（G/A）GAA GCA TAG TC	55℃	HGA480
HS45	5’-ACT TCA CG（C/T）（C/T）TCA TAG AC		HME528

DNA提取同上。PCR檢測(cè)時(shí)，反應(yīng)混合物的準(zhǔn)備按常規(guī)進(jìn)行。DNA模板量同16S rRNA基因檢測(cè)。巢式PCR第一輪反應(yīng)采用外引物對(duì)HS1及HS6。

反應(yīng)程序如下：

 3循環(huán)：94℃ 1min

         48℃ 2min

         70℃ 90sec

37循環(huán)：88℃ 1min

          52℃ 2min

          70℃ 90sec

 68℃ 總延伸 5min

第二輪PCR引物采用HS43及HS45。檢測(cè)樣本取第一輪產(chǎn)物1-2μl為模板，陽(yáng)性對(duì)照取0.5μl為模板。反應(yīng)程序同第一輪反應(yīng)。反應(yīng)程序同第一輪反應(yīng)，但退火溫度由52℃改為55℃。

3．測(cè)序及分析

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并進(jìn)行同源比較，分析當(dāng)?shù)亓餍兄昱c其它地區(qū)的變異性。

（四）病原體分離培養(yǎng)。

多用HL-60進(jìn)行嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的分離培養(yǎng)。最常用的分離方法是將白細(xì)胞部分接種培養(yǎng)基，然后將100-500μl抗凝血接種到懸浮有2×10⁵或1×10⁶細(xì)胞內(nèi), 每2-3天染色檢查包涵體，一般5-10天可查見包涵體。由于分離可能受到紅細(xì)胞的影響，因此，建議使用以下方法：

1.白細(xì)胞分離：采用密度梯度離心方法（Ficoll-Paque）。一般采用2-3 ml EDTA抗凝血，用2倍體積的無(wú)菌Hanks 平衡鹽溶液稀釋，最后采用Histopaque（Sigma，St . louis, Mo）密度梯度離心分離白細(xì)胞，可以獲得較高的白細(xì)胞，用以分離HGA。采用白細(xì)胞分離方法進(jìn)行接種時(shí)，應(yīng)注意防止操作過(guò)程中的污染。

2. 紅細(xì)胞裂解后收集白細(xì)胞（NHCl₄裂解法）。

3. 在使用含有紅細(xì)胞的標(biāo)本培養(yǎng)后，另加入宿主未感染的細(xì)胞，建立混合培養(yǎng)。

血液白細(xì)胞懸浮于2ml體積、含有5-10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，且在25 cm²培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)與培養(yǎng)細(xì)胞作用3小時(shí)。37℃、5% CO₂ 條件下振搖孵育，可增加病原體與細(xì)胞的作用。

病原體的鑒定：可通過(guò)種特異引物進(jìn)行PCR鑒定。

五、生物安全

在標(biāo)本采集、運(yùn)輸及實(shí)驗(yàn)室工作過(guò)程中，生物安全應(yīng)參照《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》中的有關(guān)要求進(jìn)行。

（一）實(shí)驗(yàn)室生物安全。

標(biāo)本滅活、病原DNA標(biāo)本提取及病原體分離操作應(yīng)在生物安全Ⅱ級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。非感染性材料的檢測(cè)可在生物安全I級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

（二）血液標(biāo)本采集安全注意事項(xiàng)。

采集病例的標(biāo)本時(shí)，應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)。采集者應(yīng)戴乳膠手套，盡量避免病例的血液外溢或直接接觸。如發(fā)生血液外溢污染環(huán)境時(shí)，應(yīng)及時(shí)采用75%酒精或常用消毒劑進(jìn)行消毒處理。應(yīng)按照對(duì)傳染性樣本的要求，對(duì)采集標(biāo)本的器具及病人止血棉球及時(shí)進(jìn)行消毒處理。防止銳器扎傷皮膚，一旦發(fā)生，應(yīng)按臨床外科要求，及時(shí)進(jìn)行傷口清創(chuàng)。如直接沾染了臨床診斷病例或確診病例的血液，除及時(shí)消毒皮膚外，應(yīng)口服強(qiáng)力霉素預(yù)防感染，服用劑量參照《人粒細(xì)胞無(wú)形體病診療方案（試行）》（附件1）。

（三）采集動(dòng)物宿主與媒介蜱標(biāo)本個(gè)人防護(hù)。

野外采集標(biāo)本時(shí)，應(yīng)穿著顏色明亮的防護(hù)服，并將衣袖或褲管口扎緊以防蜱叮咬人體，且容易發(fā)現(xiàn)蜱的附著。一旦發(fā)現(xiàn)有蜱附著體表，應(yīng)用鑷子夾取，不要用手直接摘除。野外作業(yè)或活動(dòng)的人員可使用驅(qū)避劑或防蚊油噴涂皮膚，也可用硫化鉀代替防蚊油。

（四）標(biāo)本運(yùn)輸安全注意事項(xiàng)。

應(yīng)參照《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》中的有關(guān)要求（B類）進(jìn)行。

（五）在診療及標(biāo)本的采集、包裝和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等過(guò)程中所產(chǎn)生的醫(yī)療廢物，應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》等相關(guān)規(guī)定處理。