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　手足口病（Hand-foot-mouth Disease, HFMD）是由多種人腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，是我國法定報告管理的丙類傳染病。大多數患者癥狀輕微，以發熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀。少數患者可出現無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經源性肺水腫和心肌炎等，個別重癥患兒病情進展快，可導致死亡。手足口病常出現暴發或流行，為指導各地做好手足口病的預防控制工作，制定本指南。

　　一、目的

　?。ㄒ唬┲笇пt療機構、疾病預防控制機構開展疫情報告與監測。

　?。ǘ┲笇Ъ膊☆A防控制機構開展流行病學調查、病原學監測。

　?。ㄈ┲笇Ъ膊☆A防控制機構、醫療機構開展重點場所及公眾預防控制工作。

　　二、疾病概述

　?。ㄒ唬┎≡瓕W。

　　引起手足口病的病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，包括柯薩奇病毒A組（Coxasckievirus A, CVA）的 2、4、5、7、9、10、16 型等，B組（Coxasckievirus B, CVB)的1、2、3、4、5 型等；腸道病毒71型（Human Enterovirus 71, EV71）；?？刹《荆‥chovirus, ECHO）等。其中以EV71及CVA16型較為常見。

　　腸道病毒適合在濕、熱的環境下生存與傳播，75%酒精和5%來蘇不能將其滅活，對乙醚、去氯膽酸鹽等不敏感；對紫外線和干燥敏感，各種氧化劑(高錳酸鉀、漂白粉等)、甲醛、碘酒以及56℃30分鐘可以滅活病毒。病毒在4℃可存活1年，-20℃可長期保存，在外環境中可長期存活。

　?。ǘ┝餍胁W。

　　1．傳染源。人是人腸道病毒的唯一宿主，患者和隱性感染者均為本病的傳染源，隱性感染者難以鑒別和發現。發病前數天，感染者咽部與糞便就可檢出病毒，通常以發病后一周內傳染性最強。

　　2．傳播途徑。腸道病毒可經胃腸道（糞-口途徑）傳播，也可經呼吸道（飛沫、咳嗽、打噴嚏等）傳播，亦可因接觸患者口鼻分泌物、皮膚或粘膜皰疹液及被污染的手及物品等造成傳播。尚不能明確是否可經水或食物傳播。

　　3．易感性。人對人腸道病毒普遍易感。不同年齡組均可感染發病，以5歲及以下兒童為主，尤以3歲及以下兒童發病率最高。顯性感染和隱性感染后均可獲得特異性免疫力，產生的中和抗體可在體內存留較長時間，對同血清型病毒產生比較牢固的免疫力，但不同血清型間鮮有交叉免疫。

　　4．流行特征。該病流行無明顯的地區性，全年均可發生，一般5-7月為發病高峰。托幼機構等易感人群集中單位可發生暴發。腸道病毒傳染性強、隱性感染比例大、傳播途徑復雜、傳播速度快，控制難度大，容易出現暴發和短時間內較大范圍流行。

　?。ㄈ┡R床表現。

　　手足口病潛伏期為2-10天，平均3-5天，病程一般為7-10天。

　　急性起病，發熱，口腔粘膜出現散在皰疹，手、足和臀部出現斑丘疹、皰疹，皰疹周圍可有炎性紅暈，皰內液體較少?？砂橛锌人浴⒘魈?、食欲不振等癥狀。部分患者無發熱，僅表現為皮疹或皰疹。一般預后良好；少數病例，特別是EV71感染患兒，可出現腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、神經源性肺水腫、循環障礙等，病情兇險，可致死亡或留有后遺癥。

　?。ㄋ模┲委熢瓌t。

　　目前無特異性治療方法，以支持療法為主，絕大多數患者可自愈。目前尚無特異性的疫苗。病例的治療方法參考衛生部《手足口病診療指南（2008年版）》。

　　三、病例定義

　　（一）臨床診斷病例。

　　在流行季節發病，常見于學齡前兒童，嬰幼兒多見。

　　1．普通病例：發熱伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可無發熱。

　　2．重癥病例：出現神經系統受累、呼吸及循環功能障礙等表現，實驗室檢查可有外周血白細胞增高、腦脊液異常、血糖增高，腦電圖、腦脊髓磁共振、胸部X線、超聲心動圖檢查可有異常。

　　極少數重癥病例皮疹不典型，臨床診斷困難，需結合實驗室檢測做出診斷。

　　若無皮疹，臨床不宜診斷為手足口病。

　?。ǘ嶒炇掖_診病例。

　　臨床診斷病例符合下列條件之一者，即可診斷為實驗室確診病例：

　　1．自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子、腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴結等組織標本中分離到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據表明可以導致手足口病的人腸道病毒）。

　　2．自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子等標本中檢測到CVA16 或EV71特異性核酸，或從腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴結等組織標本等標本中檢測到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據表明可以導致手足口病的人腸道病毒）的特異性核酸。

　　3．血清標本人腸道病毒型特異性中和抗體滴度≥1∶256，或急性期與恢復期血清腸道病毒特異性中和抗體有4倍或4倍以上的升高。

　?。ㄈ┚奂圆±?。

　　1周內，同一托幼機構或學校等集體單位發生5例及以上手足口病病例；或同一班級（或宿舍）發生2例及以上手足口病病例；或同一自然村發生3例及以上手足口病病例；或同一家庭發生2例及以上手足口病病例。

　　四、疾病監測

　?。ㄒ唬┮咔閳蟾妗?

　　1．個案報告。各級各類醫療機構應按照《中華人民共和國傳染病防治法》和《傳染病信息報告管理規范》的有關規定，對符合病例定義的手足口病病例進行報告。

　　如為重癥病例，請在“重癥患者”處選擇“是”；如為實驗室診斷病例，請在“實驗室結果”處選擇相應的腸道病毒病原學分型信息。

　　實行網絡直報的醫療機構應于24小時內進行網絡直報，未實行網絡直報的醫療機構應于24小時之內寄送出傳染病報告卡。

　　2．聚集性病例報告。托幼機構和學校、醫療機構發現手足口病聚集性病例時，應以最快的方式向縣（區）級疾病預防控制機構報告。

　　3. 突發公共衛生事件報告。局部地區或集體單位發生流行或暴發時，按照《突發公共衛生事件應急條例》、《全國突發公共衛生事件應急預案》、《突發公共衛生事件與傳染病疫情監測信息報告管理辦法》及有關規定，及時進行突發公共衛生事件信息報告。

　?。ǘ┎≡瓕W監測。

　　各省區市衛生行政部門要組織醫療衛生機構開展病原學監測，了解病原動態分布變化。所有重癥和死亡病例均需采樣。此外，以縣（區）為單位，每月最少需采集5例首次就診的普通病例標本；當月縣（區）病例總數少于5例時，全部采樣。

　　以?。▍^、市）為單位,在手足口病流行年份中每年至少采集20對EV71 和10對CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清,以闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動態變化，評價血清學抗體試劑盒的敏感性和特異性。

　　以?。▍^、市）為單位，每月至少從手足口病病例中分離10株毒株并做血清型別鑒定，鑒定完成后并將毒株及鑒定結果于5個工作日內報送至中國疾病預防控制中心。具備測序條件的省份，可開展VP1基因序列測定和分析，進行基因定型，序列測定完成后將序列結果于5個工作日內報送至中國疾病預防控制中心；不具備測序條件者，將毒株送至中國疾病預防控制中心進行序列測定，中國疾病預防控制中心要于28個工作日內反饋基因定型結果。

　　所有病例的采樣均由醫療機構完成，及時送至縣（區）級疾病預防控制機構或指定的檢測機構檢測。檢測機構將實驗室檢測結果于24小時內反饋給縣（區）級疾病預防控制機構；縣（區）級疾病預防控制機構接到結果后，于24小時內對檢測病例的傳染病報告卡信息進行訂正，將其病例類型訂正為“實驗室診斷”，并在“實驗室結果”處補填腸道病毒病原學分型信息。

　　各種標本采集和檢測方法詳見《手足口病標本采集及檢測技術方案》（附件1）。

　?。ㄈ┍O測信息分析與反饋。

　　各級疾病預防控制機構要每日對網絡直報系統進行瀏覽，及時對報告的病例進行審核、查重、訂正等工作，定期對監測數據進行分析，判斷發病趨勢，發現異常升高或病例呈聚集性分布或出現重癥及死亡病例時，要及時核實并向同級衛生行政部門及上級疾病預防控制機構報告，并定期向下級疾病預防控制機構和醫療機構反饋疫情分析信息。

　　五、預防控制

　?。ㄒ唬┈F場調查處置。

　　發現手足口病聚集性病例、重癥或死亡時，縣（區）級及以上疾病預防控制機構要立即組織開展現場調查處置。

　　1．流行病學調查。

　?。?）聚集性病例調查：了解聚集性病例的臨床表現、流行特征，以分析流行因素，為采取防控措施提供依據。要對首發或指示病例開展流行病學調查，填寫《手足口病個案調查表》（附件2）。

　　（2）重癥或死亡病例調查：詳細了解病例的基本信息、臨床癥狀、發病就診治療過程、感染傳播情況、病原檢測結果，以分析重癥及死亡病例的主要危險因素，填寫《手足口病重癥或死亡病例個案調查表》（附件3）。調查結束后，各省級疾病預防控制中心應將結果錄入統一數據庫，報送中國疾病預防控制中心。

　?。?）專題調查：根據當地手足口病疫情特點及流行特征，可開展專題調查，以了解當地的主要傳播方式以及感染危險因素等，為制定干預措施提供依據。專題調查的方案及其內容，應根據調查目的專門設計。

　?。?）醫療機構要協助疾病預防控制機構對病例進行流行病學調查。

　　2．傳染源的管理。

　　患兒應及時就醫，并遵醫囑采取居家或住院方式進行治療。居家患兒，家長或監護人應在社區（村）醫生的指導下，密切關注患兒的病情變化，如發現神經系統、呼吸系統、循環系統等相關癥狀時，應立即送醫院就診，同時，要盡量避免與其他兒童接觸。住院患兒應在指定區域內接受治療，防止與其他患兒發生交叉感染。

　　管理時限為自患兒被發現起至癥狀消失后1周。

　　鄉鎮衛生院/社區衛生服務中心、村衛生室/社區衛生服務站等負責本轄區居家治療的手足口病患兒的隨訪工作，掌握居家治療患兒的病情進展情況。

　　3．標本采集和檢測。

　?。?）所有重癥和死亡病例均要采集標本，可以采集咽拭子、糞便或肛拭子、皰疹液、腦脊液、血清等，死亡病例還可采集腦、肺、腸淋巴結等組織標本。聚集性病例至少要采集2例病例標本開展病原學檢測。

　?。?）醫療機構負責樣本采集，疾病預防控制機構應指導醫療機構進行相關生物學標本的采集。

　　（3）疾病預防控制機構根據本地的技術能力，對采集的標本開展核酸檢測、病毒分離；不具備技術條件時，及時送上級機構進行檢測（附件1）。

　　4．消毒措施。

　　病家、托幼機構和小學的消毒應在當地疾病預防控制機構的指導下，由單位及時進行消毒，或由當地疾病預防控制機構負責對其進行消毒處理。醫療機構的消毒由醫療機構安排專人進行。消毒方法參見《消毒技術規范》（2002版）和《手足口病疫源地消毒指南》（附件4）。

　　5．健康教育。

　　各級醫療衛生機構應在政府領導下，與當地教育、宣傳、廣電等部門密切合作，充分利用12320公共衛生公益熱線、廣播、電視、報紙、網絡、手機短信、宣傳單/宣傳畫等多種方式，開展手足口病防治知識的宣傳工作，使5歲以下兒童家長及托幼機構工作人員等了解手足口病的臨床癥狀，掌握最基本的預防措施，強調保持良好的個人衛生習慣及環境衛生措施對于有效預防手足口病的重要性，動員托幼機構老師和管理人員、兒童家長成為手足口病防控工作的主動參與者，形成群防群控。與重癥或死亡病例發病前1周或發病后有共同生活、居住史的5歲以下兒童，要對其家長或監護人進行健康教育，做好兒童的密切觀察，出現癥狀要及時就診和治療。

　?。ǘ┲攸c人群及重點機構的預防控制措施。

　　為降低人群手足口病的發病率，減少聚集性病例，避免醫院感染，各地要做好以散居兒童為主的重點人群和以托幼機構、醫療機構為主的重點場所的預防控制工作。

　　1．散居兒童的預防控制措施。

　?。?）飯前便后、外出回家后要用肥皂或洗手液等給兒童洗手；看護人接觸兒童前、替幼童更換尿布、處理糞便后均要洗手；

　?。?）嬰幼兒的尿布要及時清洗、曝曬或消毒；注意保持家庭環境衛生，居室要經常通風，勤曬衣被；

　?。?）嬰幼兒使用的奶瓶、奶嘴及兒童使用的餐具使用前后應充分清洗、消毒；不要讓兒童喝生水、吃生冷食物；

　　（4）本病流行期間不宜帶兒童到人群聚集、空氣流通差的公共場所；避免接觸患病兒童；

　?。?）兒童出現發熱、出疹等相關癥狀要及時到醫療機構就診；

　?。?）居家治療的患兒避免與其他兒童接觸，以減少交叉感染；父母要及時對患兒的衣物進行晾曬或消毒，對患兒糞便及時進行消毒處理。

　　2．托幼機構預防控制措施。

　?。?）每日進行晨檢，發現可疑患兒時，要采取立即送診、居家觀察等措施；對患兒所用的物品要立即進行消毒處理；

　　（2）出現重癥或死亡病例，或1周內同一班級出現2例及以上病例，建議病例所在班級停課10天；1周內累計出現10例及以上或3個班級分別出現2例及以上病例時，經風險評估后，可建議托幼機構停課10天；

　　（3）教育、指導兒童養成正確洗手等良好的衛生習慣；老師要保持良好的個人衛生狀況；

　?。?）教室和宿舍等場所要保持良好通風；定期對玩具、兒童個人衛生用具（水杯、毛巾等）、餐具等物品進行清洗消毒；

　　（5）定期對活動室、寢室、教室、門把手、樓梯扶手、桌面等物體表面進行擦拭消毒；

　?。?）托幼機構應每日對廁所進行清掃、消毒，工作人員應戴手套，工作結束后應立即洗手；

　?。?）托幼機構應配合衛生部門采取手足口病防控措施。

　　3．醫療機構的預防控制措施。

　?。?）各級醫療機構應加強預檢分診，專辟診室（臺）接診發熱、出疹的病例。增加候診及就診等區域的清潔消毒頻次，室內清掃時應采用濕式清潔方式；

　　（2）醫務人員在診療、護理每一位病例后，均應認真洗手或對雙手消毒，或更換使用一次性手套；

　?。?）診療、護理手足口病病例過程中所使用的非一次性儀器、體溫計及其他物品等要及時消毒；

　?。?）對住院患兒使用過的病床及桌椅等設施和物品必須消毒后才能繼續使用；

　　（5）患兒的呼吸道分泌物和糞便及其污染的物品要進行消毒處理。

　　附件：1．手足口病標本采集及檢測技術方案

　　2．手足口病個案調查表

　　3．手足口病重癥或死亡病例個案調查表

　　4．手足口病疫源地消毒指南

　　附件1

　　手足口病標本采集及檢測技術方案

　　一、采集標本的種類、保存和運輸

　?。ㄒ唬┘S便標本。

　　采集病人發病3日內的糞便標本，用于病原檢測。糞便標本采集量5-8g/份，采集后立即放入無菌采便管內，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽，4℃暫存12小時內送達實驗室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于-70℃冰箱。

　　（二）咽拭子標本。

　　采集病人發病3日內的咽拭子標本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。4℃暫存并在12小時內送達實驗室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于-70℃冰箱。

　　（三）血清標本。

　　各?。▍^、市）在手足口病流行年份中均應采集EV71 和CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清。采集急性期（發病0-7d）和恢復期（發病14-30d）雙份配對血清用于闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動態變化，評價血清學抗體試劑盒的敏感性和特異性。靜脈采集3-5ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。將血清置于-20℃以下冰箱中冷凍保存。

　?。ㄋ模┌捳钜?。

　　在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液中分離到病毒即可確診該病毒為病因，可同時采集多個皰疹作為一份標本。先用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。所采集標本4℃暫存立即（12h內）送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。

　　（五）肛拭子標本。

　　采集病人發病3日內的肛拭子標本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數下，拔出后,迅速將棉簽放入裝有3－5ml保存液（含5%牛血清細胞維持液）的15ml外螺旋的采樣管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，以防干燥。

　?。┦瑱z標本。

　　采集腦、肺和腸淋巴結等重要組織標本，每一采集部位分別使用單獨的消毒器械。每種組織應多部位取材，每部位應取2-3份約5-10g的組織，淋巴結2個，分別置于15ml-50ml無菌的有外螺旋蓋的凍存管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。

　　（七）腦脊液標本。

　　出現神經系統癥狀的病例，可采集腦脊液標本，進行病毒分離或核酸檢測。采集時間為出現神經系統癥狀后3天內，采集量為1.0-2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存立即(12h內)送達實驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于－70℃冰箱。但EV71感染神經系統時，很難在腦脊液中檢測到EV71病原。

　　臨床標本在運輸和貯存過程中要避免反復凍融。標本采集后要全程冷藏或冷凍保存和運輸，12小時內送達實驗室。依照《人間傳染的病原微生物名錄》，腸道病毒或潛在含有腸道病毒的標本按B類包裝，置于冷藏保存盒內運輸，盡量縮短運輸時間?？刹捎藐懧坊蚝娇盏榷喾N運輸方式，但在運輸過程中應采取保護措施，避免強烈震動、重力擠壓等現象。在送到省、地、市級CDC實驗室時，包裝盒內應帶冰且包裝完整。在上送標本的同時，需附帶相關的《手足口病病例臨床標本采樣登記表》。

　　二、標本采集注意事項

　　在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液或腦脊液中分離到病毒即可診斷該病毒為病因。用于采集咽拭子的無菌拭子要放在標本保存液中，如含5%牛血清維持液。用于分子生物學診斷的標本采集與病毒分離標本的采集方法一樣。為了保證檢測結果的準確性和有效性，標本應在病例發病后盡早采集，盡快檢測。不能立即檢測的標本應冷凍保存。對于血清學診斷，急性期血清應該在發病后盡早采集，恢復期血清在發病兩周后采集。標本保存液的配置見下表：

　　 保存液

　　Eagle`s液(MEM) 80.5ml

　　3%L-谷氨酰胺200mM 1.0ml

　　胎牛血清 5.0ml

　　7.5%NaHCO3溶液 3.5ml

　　青、鏈霉素

　?。ǜ?0000U/ml） 10ml

　　三、實驗室檢測操作流程

　　（一）病毒分離。

　　1.試劑配置

　?。?）細胞的生長液、維持液的配制見下表：

　　 生長液（GM） 維持液（MM）

　　Eagle`s液(MEM) 86.5ml 92.5ml

　　3%L-谷氨酰胺200mM 1.0ml 1.0ml

　　胎牛血清 10.0ml 2.0ml

　　7.5%NaHCO3溶液 2.5ml 3.5ml

　　青、鏈霉素

　?。ǜ?0000U/ml） 1.0ml 1.0ml

　?。?）糞便標本和肛拭子的處理液

　　完全PBS液中加入P．S溶液，終濃度為青霉素100單位/ml，鏈霉素為100μg/ ml。

　　完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即為完全PBS工作液。

　　A液：

　　試劑品名 加入量

　　NACL 8.00g

　　KCL 0.20g

　　Na2HPO4(無水) 0.91g

　　KH2PO4 0.12g

　　用600～800ml蒸餾水溶解以上鹽類，加蒸餾水補至1000ml，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌，即為不完全PBS工作液（不含鈣、鎂離子）。

　　B液：

　　試劑品名 加入量

　　MgCl2.6H2O 0.10g

　　溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。

　　C液：

　　試劑品名 加入量

　　CaCl2 0.10g

　　溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。

　　2．病毒分離細胞系

　　許多細胞系可支持人腸道病毒（如EV71、CVA16）生長。

　　對于檢測手足口病的病原來說，建議所有懷疑含EV71、CVA16等腸道病毒感染的標本均需接種到以下兩種細胞系：

　　? RD細胞，來源于人橫紋肌肉瘤細胞。

　　? HEp-2細胞，來源于人喉癌上皮細胞。

　　3．標本的處理

　?。?）糞便標本和肛拭子的處理

　　操作步驟：

　　1）在離心管上標記標本號；

　　2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；

　　3）在生物安全柜中將每一份糞便標本取大約2g加入標記好的離心管中（確保離心管上的標號與原始標本的標號一致）；肛拭子為2ml；

　　4）剩余的原始標本最好留在原容器中，凍存于－20℃；

　　5）確保擰緊離心管，用機械震蕩器劇烈震蕩20min；

　　6）在確保離心機的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機在1500g條件下離心20min；

　　7）在生物安全柜中將每1份標本的上清液分別吸入2個有外螺旋蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應再用氯仿處理1次）；

　　8） 1管糞便懸液凍存于－20℃作為備份，另1管存于4-8℃以備接種。

　　（2）皰疹液標本的處理

　　皰疹液標本通常直接用于RNA提取或病毒分離。

　　（3）腦脊液標本的處理

　　腦脊液標本通常直接用于病毒分離。

　?。?）咽拭子標本的處理

　　咽拭子要在標本運輸（保存）液中充分攪動（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用于病毒分離時，需要凍融一次（防止多次凍融），使細胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4℃條件下，10000 rpm離心20min，用上清接種到細胞上或直接提取RNA。如果發現有細菌污染，須用濾器過濾除菌。

　　4．接種和觀察（病毒分離）

　　（1）通常使用８ml的斜面試管培養細胞，傳細胞時，每管加細胞培養液1.5ml。顯微鏡下觀察單層細胞，以確保細胞是健康、無污染的。一個健康的單層細胞會在傳代后48小時左右形成；

　　（2）倒掉生長液（GM），換上1-1.2ml的維持液（MM）；

　?。?）每一份標本需要同時接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞，正確標記每支細胞培養管（包括標本的編號、日期、傳代數）；

　　（4）每一種細胞至少標記一管作為陰性對照；

　?。?）每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養溫度要求36℃。

　?。ɑ蛘呤褂梦降姆椒ń臃N病毒：接種標本前，倒掉生長液（GM），每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養溫度為36℃；吸附1小時后，換上1.5ml的維持液（MM）。同樣每份標本需同時接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞。

　?。?）使用倒置顯微鏡每天觀察細胞培養管，以觀察有特征性的腸道病毒致細胞病變效應（CPE）的出現（如細胞變圓，折光增強并脫離管壁等）；

　　（7）記錄接種管和對照管細胞所發生的變化至少一周，記錄CPE（1+—4+）、提示細胞受毒性反應、老化或污染的影響而發生的變化（1+，<25%; 2+, 25%-50%; 3+, 50%-75%; 4+, 75%-100%）；

　　（8）如果有特征性的腸道病毒CPE出現，要如實記錄，并觀察直到75%的細胞發生變化（3+ CPE），然后儲藏在－20℃以備二次傳代；

　?。?）第一代培養見可疑細胞病變時應繼續傳代，待細胞病變穩定出現后－20℃或－70℃凍存；

　　（10）一代陽性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現，將病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于一代病毒，所以選用二代病毒進行鑒定；

　?。?1）如果7d之后沒有CPE出現，那么盲傳1代繼續觀察7d。（注意：同一病例標本的細胞培養物不能混在一起再傳代，例如：不同細胞的培養物應單獨傳代）；

　?。?2）盲傳兩代后，仍然沒有出現CPE的，則判定為陰性；

　?。?3）注意：如果接種后24h內出現CPE，很可能是標本中的非特異性成分導致的毒性反應。取100μl陽性分離物傳二代，繼續觀察；或者在接種標本吸咐1h后用維持液清洗細胞層，可能會降低毒性反應；

　?。?4）幾個概念：

　　A：毒性反應：如果在接種后1-2d內細胞快速凋亡，這可能是由于標本中含有毒性物質而導致的非特異性毒性反應。這些已接種標本的試管應在-20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型細胞中（此時是第二代）。如果又出現了毒性反應，那么應該取原始標本用PBS稀釋10倍，再次接種到同種細胞中。這時應被認為是第一代。

　　B：微生物污染：由于細菌污染而造成培養液混濁或細胞死亡經常使病毒造成的CPE無法確定或根本無法出現。重新取原始標本，用氯仿或抗生素處理，按上述步驟重新接種到新鮮細胞上。

　　C：盲傳：有時一周之后傳代細胞會老化，甚至細胞對照也出現了病變。這時已接種標本的試管應在-20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型的新鮮單層細胞中，再觀察7-10d。如果盲傳兩代后仍然沒有產生CPE，那么認為這個標本是陰性的。

　　5．病毒分離結果解釋

　　RD細胞支持HFMD的主要病原體——CVA16和EV71等多種腸道病毒的復制，CVA16和EV71均能在RD細胞培養中引起特殊的腸道病毒致細胞病變效應（CPE），表現為細胞圓縮、分散、胞漿內顆粒增加，最后細胞自管壁脫落。但相同滴度的CVA16和EV71在RD細胞中生長的速度不同，EV71的生長速度要快于CVA16，表現為EV71感染RD細胞后出現CPE的時間比CVA16早，EV71接種細胞后出現CPE很快，但CVA16一般要經過2次以上傳代才出現明顯的CPE。

　　若在使用RD細胞分離的同時再增加HEp-2細胞，可提高腸道病毒的分離率（分離出其他可能致HFMD的病原體，如一些柯薩奇B組病毒）。但CVA16和EV71在HEp-2細胞中均不繁殖。

　?。ǘy定人雙份血清標本的中和抗體滴度。

　　比較患者急性期血清與恢復期血清中和抗體滴度，可作為腸道病毒感染的血清學診斷方法，最常用的是中和實驗，即用微量板法測定抗體滴度，是目前人腸道病毒抗體檢測的最常用方法，該方法精確且具有型特異性。

　　作為腸道病毒感染的診斷方法之一，可以測定血清中腸道病毒中和抗體的滴度，通常用急性期血清與恢復期血清滴度進行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。但是，腸道病毒隱性感染也很常見，所以在評估檢測結果時就要小心一些。在中和實驗中，一般要用人腸道病毒參考毒株（即原型株，EV71原型株為BrCr株，CVA16原型株為G-10株）或流行株，有時同時（或單獨）使用臨床分離株會有助于得到更準確的檢測結果。

　　使用對腸道病毒敏感的細胞，如RD細胞。用病毒（血清）稀釋液（下面液體配制中的C液，可用維持液代替）稀釋血清和制備病毒懸液，因為是用病毒來確定血清中抗體的滴度，所以要使用參考病毒（原型株），但有時使用所分離到的毒株（臨床分離株）有助于得到更準確的檢測結果，但分離株的滴度（100 CCID50/0.05ml）要事先測定。

　　中和實驗的檢測原理：病毒感染敏感靶細胞后，引起細胞形態學變化，出現CPE，特異性中和抗體與病毒結合后，可使病毒顆粒失去感染性，抑制CPE的出現。

　　1．液體配制

　　A液：血清處理液：（100ml中含下列試劑成份）

　　MEM 85ml

　　3% L-谷氨酰胺 1ml

　　7.5%碳酸氫鈉 2ml

　　胎牛血清 2ml

　　青、鏈霉素（各10000U/ml） 10ml

　　B液：細胞營養液：（按生長液配方配制，100ml中含下列試劑成份）

　　MEM 85ml

　　3% L-谷氨酰胺 1ml

　　7.5%碳酸氫鈉 2ml

　　HEPES 1ml

　　胎牛血清 10ml

　　青、鏈霉素（各10000U/ml） 1ml

　　C液：病毒（血清）稀釋液：（按維持液配方配制，100ml中含下列液體）

　　MEM 93ml

　　3% L-谷氨酰胺 1ml

　　7.5%碳酸氫鈉 2ml

　　HEPES 1ml

　　胎牛血清 2ml

　　青、鏈霉素（各10000U/ml） 1ml

　　2．攻擊病毒CCID50滴定和滴度梯度制備

　　（1）將增殖后的病毒懸液凍融3次，然后在4℃、12000rpm條件下離心10min，取上清液分裝于10支凍存管中，每管1.5ml，一般每管應在一次試驗中用完，有剩余應高壓后廢棄；

　　（2）加Eagle液10倍系列稀釋為10-1至10-8病毒液，各加入細胞板內，每孔50μl，每稀釋度4孔細胞；

　?。?）每孔加細胞懸液50μl，同時設細胞對照（50μl稀釋液+50μl細胞懸液）， 36℃培養7d，觀察細胞病變；

　?。?）按Behrens-K?rber公式計算出分離病毒株的CCID50；

　　log CCID50 = L-d (S-0.5)，其中：

　　L = 實驗中使用的最低稀釋度的對數值；

　　d = 稀釋梯度的對數值；

　　S = 終判時陽性部分的總和（即出現CPE的細胞孔所占的比例之和）。

　　（5）正式試驗前應先滴定攻擊病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID50的病毒載量；

　?。?）按照計算好的稀釋比例配制攻擊病毒，求出試驗所需的病毒總量（即100 CCID50/0.05ml）；

　?。?）取3支小試管，每只加病毒稀釋液（液體配制中的C液）0.9ml；

　　（8）用帶濾芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已經稀釋好的攻擊病毒液（即100CCID50/0.05ml）到第一支小試管中，換另一支ART吸尖，輕輕并徹底地混勻，避免產生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至1 CCID50/0.05ml和0.1 CCID50/0.05ml。

　　3．稀釋血清

　　（1）發病1-3d內采取患者急性期血清，發病后2-4周采取恢復期血清，分別凍存在-20℃備檢。

　　（2）取無菌小試管若干支（每份血清使用一支）置試管架上，每管加血清處理液（上面液體配制中的A液）0.3ml，加待測血清0.1ml，蓋緊塞子，震搖混勻，放4℃冰箱過夜，即為1：4稀釋血清。次日56℃、30min滅活。

　?。?）打開獨立無菌包裝48孔組織培養板，縱向使用，每孔加血清稀釋液（上面液體配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器吸取處理過的血清0.1ml加入第一孔（即為1：16），吹吸8-10次，吸0.1ml加入第二孔（即為1：64），依次至1：1024，血清稀釋的過程中不必更換吸尖。即每份血清標本進行4倍倍比稀釋，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。

　?。?）每份血清標本的每個稀釋度都要平行做兩孔。

　　4．病毒中和抗體測定的操作步驟：

　?。?）取一塊96孔板橫向使用，每塊板可以做8份（4對）待測血清，版面設計如下圖所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀釋度的待測血清0.05ml，不必更換吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀釋度的待測血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀釋度的待測血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀釋度的待測血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀釋度的待測血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）為每份待測血清對照孔，每孔中補加稀釋液0.05ml；

　　（2）上述孔中分別加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已經稀釋為100 CCID50/0.05ml）；

　?。?）蓋好蓋子后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO2孵箱中孵育2h；

　　（4）另取一塊96孔板縱向使用，做100 CCID50/0.05ml病毒滴度的核實（每次實驗都必須做）。每孔先加病毒稀釋液（試劑配制中的C液）0.05ml，然后從0.1 CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每個稀釋度8孔，不必更換吸尖，一直加至100 CCID50/0.05ml；同時留出4孔做為細胞對照孔，每孔加入0.1ml病毒稀釋液，然后放入4℃冰箱中暫存；

　?。?）在孵育期間，用消化液消化細胞，準備細胞懸液，細胞懸液的濃度為2×105個/ml，每塊96孔板至少需要準備10ml；

　?。?）孵育結束后每個待測血清孔、血清對照孔（待檢標本板）和病毒回滴孔和細胞對照孔（病毒回滴板）分別加入0.1ml細胞懸液，然后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO2孵箱中孵育培養；

　?。?）使用倒置顯微鏡每天觀察CPE，并記錄病毒滴定結果，以不產生細胞病變的血清最高稀釋度的倒數為終點效價。當100 CCID50/0.05ml的病毒對照孔出現完全病變時，判定最終結果（約5~7d）；

　?。?）注意：如果病毒對照結果（病毒回滴）不在32~320 CCID50/0.05ml的范圍內，實驗無效，就要重復實驗。

　　5．結果判定

　　當最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現細胞病變，另一孔不出現細胞病變，該稀釋度的倒數計即為該血清標本的中和抗體效價；當高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數即為該血清標本的中和抗體效價；當兩個相鄰稀釋度血清均出現1孔細胞病變，另1孔不出現細胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數即為該血清標本的中和抗體效價。

　　對于HFMD的雙份血清中和實驗結果來說，如果恢復期血清較急性期血清EV71或CVA16中和抗體滴度出現4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現4倍或4倍以上增高可證實該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關實驗證實；如果單份血清中和抗體滴度大于1:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1:128判定為可疑陽性。

　?。ㄈ┠孓D錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）。

　　1．RNA提取

　　可使用多種商業化試劑盒來提取RNA，針對臨床標本應選擇質量較高的“用于臨床標本病毒RNA提取的試劑盒”，也可使用全自動RNA提取儀進行提取。針對病毒分離物，核酸提取比較容易，大部分商業化RNA提取試劑盒都可有效的提取到RNA。RNA提取依據使用的試劑不同，嚴格按說明書進行操作。

　　2．逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）

　?。?）引物序列合成

　　國家脊灰實驗室自行設計3對引物，分別為人腸道病毒通用引物、EV71特異性引物和CVA16特異性引物。各省CDC依據引物序列在質量有保證的公司合成,引物合成后,需要做預實驗，保證引物合成沒有質量問題后,分發給地市級CDC。

　　1）人腸道病毒（包括EV71、CVA16）核酸檢測通用引物序列：

　　PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3`

　　PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`

　　2）EV71核酸檢測引物序列：

　　EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`

　　EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`

　　3）CVA16核酸檢測引物序列：

　　CVA16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`

　　CVA16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`

　?。?）實驗設計

　　1）在PCR記錄紙（實驗記錄紙）上記錄本次實驗操作者姓名，實驗日期，所鑒定標本的名稱以及標本的順序，與PCR儀排列的順序一致。

　　2）標記好加標本和對照的PCR管（陽性對照，陰性對照和試劑對照）。

　　A：陽性對照：參比RNA，省級CDC提供（只是在初次使用，常規不建議使用，以防污染）。

　　B：陰性對照：使用正常細胞RNA或臨床標本腸道病毒陰性的RNA（每次實驗要設立）。

　　C：試劑對照：用去離子水代替標本（試劑初次使用時必須做）。

　　（3）RT-PCR擴增反應和條件

　　1）從臨床標本或病毒中提取的RNA和各種RT-PCR試劑應該一直放在冰浴盒上；

　　2）配下列試劑主溶液：

　　10×PCR Buffer???????????????????????????????????????????????????????????????????5.0μl

　　dNTPs（2.5mM each）???????????????????????????????????????????????????????2.0μl

　　上游引物（0.1μg/μl）?????????????????????????????????????????????????????????1.0μl

　　下游引物（0.1μg/μl）?????????????????????????????????????????????????????????1.0μl

　　RNA酶抑制劑（RNasin,40U/μl）??????????????????????????????????????0.5μl

　　Taq DNA聚合酶（5U/μl）?????????????????????????????????????????????????0.5μl

　　AMV逆轉錄酶（10U/μl）??????????????????????????????????????????????????1.0μl

　　模板RNA??????????????????????????????????????????????????????????????????????????3.0μl

　　RNase Free dH2O???????????????????????????????????????????????????????????36.0μl

　　 50.0μl

　　3）在PCR儀上進行RT-PCR反應，反應步驟如下：

　　42℃????????????????????????45min

　　95℃????????????????????????3min

　　95℃????????????????????????20s

　　45℃????????????????????????25s ×32個循環

　　72℃????????????????????????30s

　　72℃????????????????????????10min

　　4℃????????????????????????Soak

　　3．電泳分析

　?。?）將已經聚合的3%的瓊脂糖凝膠放在電泳裝置上；

　?。?）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 電泳載樣緩沖液（每個反應需1μl）。再加上5μl的PCR反應產物與之混合；

　　（3）將電泳緩沖液倒在電泳裝置中，用吸尖將樣品與載樣緩沖液的混合溶液加到孔中；

　?。?）蓋上蓋子，接通電源，以10V/cm電壓（恒定電壓）電泳，大約35-40min，直到溴酚藍跑到凝膠的底部的時候，停止電泳；

　?。?）將膠取出，并注意保持凝膠的方向；

　　（6）在1μg/ml的溴化乙錠溶液中染色15min，

　　注意：溴化乙錠溶液是有毒、致畸、并且致腫瘤的物質，操作時要加小心，并戴雙層手套。如果儲存在避光的容器中，溴化乙錠溶液可以重復使用。溴化乙錠廢棄物按醫療廢棄物中化學品的有關規定處理。

　　（7）在蒸餾水中涮一下凝膠；

　　（8）在紫外透射儀下觀察PCR產物電泳結果，并照相作記錄。

　　有條件的實驗室可以使用全自動電泳分析儀。

　　4．結果解釋

　　使用全自動電泳分析儀的實驗室可以通過儀器自動讀取PCR產物大小，來判斷結果。通過瓊脂糖凝膠做PCR產物電泳的實驗室，需要參照DNA分子量對照對照，比較標本的PCR產物與陽性對照的PCR產物在凝膠上的位置以及大小來解釋結果。

　　RT-PCR實驗結果解釋表

　　待檢標本RT-PCR結果 鑒定結果

　　HEV(-), EV71(-), CVA16(-) 非腸道病毒（NEV）

　　HEV(+), EV71(-), CVA16(-) 非EV71、CVA16的其它腸道病毒

　　HEV(+), EV71(+), CVA16(-) EV71

　　HEV(+), EV71(-), CVA16(+) CVA16

　　(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）

　　1. 病毒核酸提取

　　參考常規RT-PCR病毒核酸提取步驟和注意事項。

　　2. Real-time RT-PCR （rRT-PCR）

　　依據不同廠家的試劑盒，嚴格按相應說明書操作和判斷結果。有5種試劑盒，分別為One Step Real-time PCR法檢測EV71病毒核酸（單通道檢測）；One Step Real-time PCR法檢測CVA16核酸（單通道檢測）；One Step Real-time PCR法檢測腸道病毒核酸（單通道檢測）；One Step Real-time PCR法同時檢測EV71和CVA16核酸（雙通道檢測）；One Step Real-time PCR法同時檢測EV71和腸道病毒核酸（雙通道檢測）。下面舉2個例子來說明單通道檢測和雙通道檢測的操作規程和注意事項。

　?。?） One Step Real-time PCR法檢測EV71病毒核酸（單通道檢測）

　?、俜磻w系配置：反應體系共25μl，模板量可根據樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5μl的RNA模板量），不夠部分以水補足。如選用另外試劑盒，反應體系及條件隨之變化。

　　a.從試劑盒中取出相應的試劑，反應液在室溫融化后，瞬時離心，按n+1配置反應體系（n=樣本數+1管陽性對照+1管陰性對照），每個測量反應體系配置如下表：

　　試劑組成 1份樣品的量

　　熒光RT-PCR反應液 12.5μl

　　逆轉錄酶 0.5μl

　　Taq酶 0.5μl

　　引物和探針 1.5μl

　　H2O 5μl

　　b.將上述反應液混勻離心后，按照每管20μL分裝于各熒光PCR儀適用的PCR管中。

　　c.加樣：將提取好的樣本RNA，分別加入上述分裝好的PCR反應管中，模板量可根據樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5ul模板量），不夠部分以水補足。總反應體積25μL。

　　②熒光RT-PCR循環條件設置

　　程序 循環數 溫度（攝氏度） 反應時間（分鐘：秒）

　　1 1 42℃ 30min

　　2 1 95℃ 2min

　　3 40 95℃ 10sec

　　 60℃ 35sec

　　 60℃時收集熒光信號

　?、蹖φ赵O置

　　陰性對照：核酸提取時以滅菌雙蒸水代替標本，每次實驗應設立。

　　陽性對照：由省級實驗室提供EV71陽性核酸（只在評價試劑時使用）

　?、芙Y果分析條件設定和結果判斷

　　閾值設定

　　原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，結果顯示陰性為準，或可根據儀器噪音情況進行調整。

　　Ct值≤35.0的樣本為陽性。

　　38.0> Ct值>35.0的樣本為臨界值。

　　Ct值≥38.0的樣本或無數值的標本為陰性。

　　（2） One Step Real-time PCR法同時檢測EV71和CVA16核酸（雙通道檢測）

　　雙通道可以同時檢測EV71和CVA16核酸,在提取核酸后短時間(2.5小時)內檢測到標本中是否含EV71或CVA16核酸。

　　①反應體系配置

　　反應體系共25μl，模板量可根據樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5μl模板量），不夠部分以水補足。如選用另外試劑盒，反應體系及條件隨之變化。

　　a.先將試劑解凍，從試劑盒中取出相應的試劑，反應液在室溫融化后，瞬時離心，按n+1配置25μl反應體系（n=樣本數+1管陽性對照+1管陰性對照），每個測量反應體系配置如下表：

　　b.將下述反應液混勻離心后，按照每管20μL分裝于適用的PCR管中。

　　試劑組成 1份樣品的量

　　熒光RT-PCR反應液 12.5μl

　　逆轉錄酶 0.5μl

　　Taq酶 0.5μl

　　引物和探針 3μl

　　H2O 3.5μl

　　c.加樣：將提取好的樣本RNA，分別加入上述分裝好的PCR反應管中，模板量可根據樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5ul模板量），不夠部分以水補足?？偡磻w積25μL。

　　②熒光RT-PCR循環條件設置

　　程序 循環數 溫度（攝氏度） 反應時間

　　1 1 42℃ 30 min

　　2 1 95℃ 2 min

　　3 40 95℃ 10 s

　　 60℃ 35 s

　　 60℃時收集熒光信號

　　③結果分析條件設定和結果判斷

　　陰性對照：核酸提取時以滅菌雙蒸水代替標本。

　　陽性對照：提取好的陽性核酸作為模板RNA。

　　閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，結果顯示陰性為準，或可根據儀器噪音情況進行調整。

　　Ct值≤35.0的樣本為陽性。

　　Ct值無數值的標本和Ct值≥38.0的樣本為陰性樣本。

　　38.0> Ct值>35.0的樣本為臨界值。

　　注：熒光PCR同時讀取FAM和HEX，進行雙通道檢測，FAM熒光Ct值為CVA16的結果，HEX熒光 Ct值為EV71的結果。

　　四、生物安全

　　根據2006年1月11日衛生部制定的《人間傳染的病原微生物名錄》，柯薩奇病毒、?？刹《尽V71型和目前分類未定的其他腸道病毒均屬于危害程度第三類的病原微生物。因此在保證安全的前提下，對臨床和現場的未知樣本檢測操作可在生物安全II級或以上防護級別的實驗室進行，涉及病毒分離培養的操作，應加強個體防護和環境保護。

　　操作糞便、腦脊液和血液等臨床標本時要特別注意生物安全，要在II級生物安全柜中進行標本處理、病毒分離和病毒鑒定，無脊灰疫苗免疫史的人員要進行脊灰疫苗免疫。

　　滅活后的血清抗體檢測與PCR檢測可在生物安全I級實驗室進行。

　　所有操作應遵守國家相關法律法規。