美國(guó)進(jìn)口西尼羅病毒檢測(cè)試劑盒到貨！
用途
美國(guó)FOCUS西尼羅河（West Nile）病毒IgG ELISA，利用了西尼羅重組抗原檢測(cè)人體血清或血漿中的西尼羅抗體。本實(shí)驗(yàn)僅用于輔助診斷人感染了西尼羅病毒，不用于篩查血液或血液成分。僅供專業(yè)人員體外診斷使用。
概述
感染了西尼羅病毒會(huì)導(dǎo)致包括腦炎等一系列癥狀的疾病，西尼羅病毒在世界廣泛傳播，已在50多個(gè)國(guó)家檢測(cè)出該病毒。本試驗(yàn)經(jīng)CDC提供的試劑檢驗(yàn)與驗(yàn)證。本試驗(yàn)使用了一種稱為WNRA的重組抗原，它可以作為西尼羅病毒感染的快速血清學(xué)指標(biāo)，WNRA蛋白是一種重組抗原，它是由含有西尼羅病毒兩個(gè)抗原的序列多肽構(gòu)成。
實(shí)驗(yàn)的原理
檢測(cè)西尼羅病毒IgG ELISA 是基于兩步夾心法原理制造的。
提供的材料
1. 微孔板（96孔 12x8）：即用 每孔均包被結(jié)合西尼羅重組抗原的單抗。2－8℃下保存至保質(zhì)期。
注意：WNRA和NCA已包被于微孔板。
2. IgG樣品稀釋液：1支 25ml 即用 2-8℃下保存至使用。
3. IgG陰性質(zhì)控：1支 30ul 2-8℃下保存至使用。要長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，將其分裝于小瓶里，在-70℃下儲(chǔ)存。
4. IgG陽性質(zhì)控：1支 30ul 2-8℃下保存至使用。要長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，將其分裝于小瓶里，在-70℃下儲(chǔ)存。
5. 洗滌液（10X）：1瓶 120ml 2－8℃下保存至使用。
6. EnWash：1瓶 20ml 2－8℃下保存至使用。
7. 酶聯(lián)物：一瓶6ml 即用 2－8℃下保存至使用。
8. TMB底物液： 1支 9ml 即用 2－8℃下保存至使用。
9. 終止液；1支6ml 即用 2－8℃下保存至使用。
試劑應(yīng)避免反復(fù)凍融。
操作步驟
在使用前將所有試劑和樣品平衡至室溫，并輕輕倒轉(zhuǎn)使其充分混勻。
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
將10X的濃縮洗滌液稀釋,將120ml的濃縮洗滌液加上1080ml的蒸餾水，搖勻，至無任何沉淀，稀釋好的洗滌液最多可在室溫下放置兩個(gè)星期。
準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需的板條，剩余的板條應(yīng)盡快放入袋子里重新密封，在2－8℃下儲(chǔ)存至保質(zhì)期。
操作步驟
1. 標(biāo)記將要使用的板條，注意微孔板已經(jīng)按照統(tǒng)一排列，如下所述包被西尼羅抗原和質(zhì)控抗原。
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西尼羅抗原 |
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板條＃1 |
板條＃2 |
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A |
WNRA |
WNRA |
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B |
WNRA |
WNRA |
|
C |
WNRA |
WNRA |
|
D |
WNRA |
WNRA |
|
E |
NCA |
NCA |
|
F |
NCA |
NCA |
|
G |
NCA |
NCA |
|
H |
NCA |
NCA |
2. 將血清樣品﹑陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控同樣地用樣品稀釋液按1：300稀釋。
3. 每孔加入50ul稀釋后的樣品，以下為一個(gè)血清樣品使用一個(gè)板條的典范。
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板條1 |
板條2 |
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血清樣品 |
|||
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A |
IgG N |
樣品1 |
|
|
B |
IgG N |
樣品1 |
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|
C |
IgG P |
樣品2 |
|
|
D |
IgG P |
樣品2 |
|
|
E |
IgG P |
樣品2 |
|
|
F |
IgG P |
樣品2 |
|
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G |
IgG N |
樣品1 |
|
|
H |
IgG N |
樣品1 |
|
4. 封板，在濕潤(rùn)的溫育器里37℃下溫育1小時(shí)。
5. 溫育后，用自動(dòng)洗板機(jī)，使用洗滌液洗板6次。
6. 在每孔中加入50ul的酶聯(lián)物。
7. 封板，在濕潤(rùn)的溫育器里37℃下溫育1小時(shí)。
8. 溫育后，用自動(dòng)洗板機(jī)，使用洗滌液洗板6次。
9. 每孔加入150ul的EnWash，在室溫下溫育5分鐘
10. 溫育后，用自動(dòng)洗板機(jī)，使用洗滌液洗板6次。
11. 每孔加入75ul的TMB底物液。
12. 封板，在室溫下，避光處溫育10分鐘。
13. 每孔加入50ul的終止液終止反應(yīng)。
14. 在450nm處讀取吸光率。
結(jié)果的計(jì)算
結(jié)果的變化將會(huì)非常大，以下結(jié)果僅供指引。
計(jì)算ISR值：
計(jì)算在同一實(shí)驗(yàn)里WNR抗原的兩個(gè)陰性質(zhì)控的平均值，計(jì)算同一實(shí)驗(yàn)里NC抗原的兩個(gè)陰性質(zhì)控的平均值，用WNRA/NCA，得出陰性質(zhì)控的ISR值。同樣地計(jì)算陽性質(zhì)控和樣品得ISR值，陽性質(zhì)控的ISR值應(yīng)高于3.0，陰性質(zhì)控的ISR值應(yīng)低于1.5。
|
ISR |
結(jié)果 |
解釋 |
|
≤2.0 |
陰性 |
沒有檢測(cè)到IgG抗體 |
|
2.0－3.0 |
可疑 |
需確證實(shí)驗(yàn) |
|
≥3.0 |
陽性 |
存在IgG抗體，建議做確定性實(shí)驗(yàn) |
結(jié)果的判斷：
在某些特殊的例子中，曾報(bào)道有假陽性，但對(duì)梅毒病人無限制。假如樣品的ISR值大于2.0，但是WNRA和NCA的OD值均偏低，可視為潛在假陽性。以下為樣品1排除標(biāo)準(zhǔn)的范例。
排除標(biāo)準(zhǔn)：
計(jì)算陰性質(zhì)控的WNRA和NCA值：
|
WNRA |
NCA |
|
|
NO.1 |
0.153 |
0.126 |
|
NO.2 |
0.125 |
0.110 |
|
總計(jì) |
0.260 |
0.236 |
平均WNRA=0.260/2=0.130
NCA=0.236/2=0.118
ISR=0.130/0.118=1.10
任何陰性質(zhì)控的ISR值高于1.5，則實(shí)驗(yàn)需要重做。
計(jì)算陽性質(zhì)控的WNRA和NCA值：
|
WNRA |
NCA |
|
|
NO.1 |
0.635 |
0.190 |
|
NO.2 |
0.655 |
0.178 |
|
總計(jì) |
1.290 |
0.368 |
平均WNRA=1.290/2=0.645
NCA=0.368/2=0.184
ISR=0.645/0.184=3.5
任何陽性質(zhì)控的ISR值低于3.0，則實(shí)驗(yàn)需要重做。
以下標(biāo)準(zhǔn)是必需遵守的，不滿足以下標(biāo)準(zhǔn)，試劑出現(xiàn)了質(zhì)量問題或操作錯(cuò)誤，實(shí)驗(yàn)需重做。
|
因素 |
范圍 |
|
平均陰性質(zhì)控讀數(shù) |
＜0.400 |
|
平均陽性質(zhì)控讀數(shù) |
＞0.400 |
|
陽性質(zhì)控的ISR值 |
＞3.000 |
| , ,
陰性質(zhì)控的ISR值 |
＜1.500 |
解釋結(jié)果
1. 樣品的ISR值大于3.0視為陽性。
2. 陽性結(jié)果需重做證明。
3. 樣品的ISR值小于2.0視為陰性。
4. 樣品的ISR值小于3.0但是大于2.0，視為未確定，但是很有可能陽性，實(shí)驗(yàn)需一式三份重做。
5. ISR值大于2.0是因?yàn)閃NRA和NCA的值都低造成的，應(yīng)該視為潛在假陽性。
樣品1低OD值的范例：
計(jì)算樣品的WNRA和NCA值：
|
WNRA |
NCA |
|
|
NO.1 |
0.044 |
0.190 |
|
NO.2 |
0.016 |
0.007 |
|
總計(jì) |
0.060 |
0.026 |
平均WNRA=0.060/2=0.030
NCA=0.026/2=0.013
ISR=0.030/0.013=2.31
雖然樣品的ISR值高于2.0，但是本樣品需視為假陽性，因?yàn)槠銸D值低，而且遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離了相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)品，這通常在空白值高的情況下發(fā)生。
要進(jìn)一步證實(shí)樣品，所有陽性的結(jié)果都要用6，2層析稀釋滴定法重做，與相同滴定法的陰性質(zhì)控相比較，假如曲線是？？的，平的或者是波浪型的曲線，則表明為假陽性的結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)的局限性
1. 樣品的OD值高于抗原質(zhì)控（非WNRA）,導(dǎo)致ISR值小于3.0，則可能為假陰性，再釋稀樣品重新實(shí)驗(yàn)，可能會(huì)獲得真正的ISR值。
2. 既然這不是一個(gè)直接檢測(cè)的方法，則需考慮假陽性和假陰性存在的可能性。
3. 所有有反應(yīng)的樣品，應(yīng)用確定性實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。
4. 本實(shí)驗(yàn)提供的試劑，盡可能地檢測(cè)血清或血漿中的WNRA反應(yīng)性抗體水平。
5. 應(yīng)避免反復(fù)凍融樣品和試劑。
6. 不要使用溶血或脂血的樣品，它們會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。
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