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1.       目的

制定沙門氏菌屬診斷血清使用程序，指導對沙門氏菌屬進行血清學分型。

2.       原理

用沙門氏菌屬的代表菌株制成滅活菌抗原分別或混合免疫家兔所得的血清，經吸收出去非特異性凝集素后制成，通過凝集試驗原理供沙門氏菌屬常見菌型定型。

3.       試劑及實驗設備

3.1    沙門氏菌屬診斷血清

3.2    試劑保存：2~8°C避光保存，防止凍結，在有效期內使用。

3.3    實驗設備：玻片、吸樣槍、接種環、水浴箱、玻璃管、血平板、營養瓊脂、電熱高溫接種滅菌器。

4.       程序步驟

4.1    將診斷血清于冰箱取出后平衡至室溫。

4.2    選擇經初步生化檢測符合沙門菌生物特性的疑似菌落。

4.3    菌群分析

將經18~24h血平板上純培養的待檢菌，先用O多價A~F群血清進行凝集試驗，如陽性，提示待檢菌可能屬于A~F群范圍內，因97%以上的沙門菌都包括在A~F6個O群之內，如果不凝再使用其他O抗血清進行凝集試驗，如與其中一種抗血清凝集，待檢菌即屬于相應的菌群。若與多價O抗血清不凝集，有如下3種可能：①含有Vi抗原；②A~FO群之外的沙門菌；③沙門氏菌屬以外的細菌。可按下述方法進一步檢測，將純菌落用無菌生理鹽水洗下，制成濃菌液，再分成2份。1份不經處理，為活菌液，另1份放100°C水浴中30min，為加熱菌液。取活菌與Vi抗血清，取加熱菌與Vi抗血清凝集，加熱菌與Vi抗血清、A~F多價O抗血清分別進行玻片凝集試驗。根據結果作如下分析：①活菌與Vi抗血清凝集，加熱菌與Vi抗血清凝集者，可能屬于C群或D群菌，用O₇和O₉抗血清定群；②活菌與Vi抗血清不凝，可能屬于A~FO群之外的沙門菌或其他菌屬細菌，需進行生化試驗定屬，若符合沙門氏菌屬細菌特征，可送CDC鑒定；③加熱菌與Vi抗血清凝集，而與A~F多價O抗血清不凝集者，可報告為陰性。

4.4    血清型分析

菌群確定后，分析被檢菌的鞭毛抗原成分。先分析第1相鞭毛抗原，再分析第2相鞭毛抗原。第1相鞭毛抗原分析：根據菌群分析結果，分別選用第1相鞭毛因子血清進行玻片凝集試驗。第2相鞭毛抗原分析：所用抗血清，通常是復合因子（1、2、3、5、6、e、n、I、w）血清。單相菌，如第1相已確定，可結合菌群分析及生化反應結果判斷血清型。如為雙相菌，只分析出第1相鞭毛抗原，大多數也可結合菌群分析和生化結果判斷血清型，必要時進一步探索第2相鞭毛抗原。若只分析出第2相鞭毛抗原，須進一步探索分析第1相抗原。探索另1相抗原可按下述方法和步驟進行。如“小內管”法，一支已融化半固體瓊脂，插入一支無菌兩端相通小玻璃管于培養基當中，長度稍高出半固體液面。待瓊脂泠卻凝固，用接種環取1~2環待抑制相H抗血清，放入小內管的瓊脂表面，然后接種被誘導菌株于小內管含抗血清瓊脂層面，35°C孵育4~6h或過夜，取小內管外半固體瓊脂層生長培養物，接種于平板或直接做凝集反應，可獲得待誘導相的菌株。有些種的確定是靠鞭毛抗原中的微小差異來分析的，因而獲得豐富鞭毛抗原的培養物十分重要。

4.5    將經18~24h血平板上純培養的待檢菌，用生理鹽水制備2麥氏單位的菌懸液，取診斷血清20μL于潔凈玻片上，然后取20μL待檢菌懸液與血清混勻，輕輕搖動玻片，1min內呈現明顯凝集者為陽性，呈均勻渾濁者為陰性，每次凝集試驗均應以生理鹽水作為陰性對照試驗。

4.6    根據其生化反應和與O抗血清、Vi抗血清、H抗血清的凝集結果對照沙門氏菌屬國內常見菌型診斷抗原表，確定沙門菌的菌型。

4.7    沙門氏菌屬國內常見菌型診斷抗原，見附表

5.       質量控制

O多價A~F群血清選擇傷寒沙門菌ATCC14028為陽性對照；大腸埃希菌ATCC25922為陰性對照

6.       質量記錄

7.       參考文獻

[1]     盧錦漢主編.醫學生物制品學.北京.人民衛生出版社.1995

[2]     中國生物制品規程（2000年版）.北京.化學工業出版社.2000

附表：沙門氏菌屬國內常見菌型診斷抗原表