呼吸道合胞病IgM檢測試劑盒
呼吸道合胞病IgM檢測試劑盒(酶聯免疫法)
1、實驗原理
此酶免試劑盒可用于人血清中抗RSV(呼吸道合胞病毒)IgM抗體的體外定性和定量檢測。
2、前言說明
在患有細支氣管炎或肺炎的六個月大的嬰兒中,可發現呼吸道RSV感染和特定的臨床癥狀之間有明顯的聯系。在年齡稍大 的嬰兒和小兒中,感染癥狀會溫和一些。 25%以上的RSV呼吸道感染都是可被察覺的。由于RSV再次感染的可能性,人們認為這些再次感染的抗體與成年人中這些疾病的緩慢發展過程(類似于感冒) 有關。然而,特別是早年,血清抗體并不能成為抗呼吸道感染的有效保護。因此,這種病原體可能會引起細支氣管炎或引起四歲大的嬰兒患肺炎。基于呼吸道合胞病 毒抗原的關系,我們可以將呼吸道合胞病毒分為兩大類(A和B)。病毒的表面糖蛋白(G糖蛋白和融合糖蛋白)可產生病毒抑制抗體。RSV的A和B類病毒的G 糖蛋白與F糖蛋白相比明顯不同。用于RSV血清學診斷的補體結合實驗,其結果不是很理想。用于RSV感染的血清學診斷的酶免檢測具有很高的診斷價值,因為 酶免檢測靈敏度很高,并且可區分不同抗原的免疫球蛋白。在RSV感染中,IgM抗體反應可能不會出現或很弱,以至于不能獲得可靠的實驗結果。在一急性感染 中,因為IgA抗體可能會持續幾個月或幾年,所以單一樣品中的IgG抗體檢測并不明顯。被推薦為急性RSV感染血清學檢測方法是檢測血清中的IgG抗體 (雙份,要求其濃度明顯提高了)。
3、實驗原理
此固相ELISA試劑盒利用的夾心法原理。包被板上包被了抗原。用對人IgM具有特異性的酶標二抗來檢測結合到包被抗原的樣品特異性抗體。底物反應后,所顯示的顏色強度與檢測到的IgM特異性抗體的量成正比。樣品的結果可直接使用標準曲線得。
4、試劑盒組成:
4×2ml |
標準品A-D |
1;10;50;150U/mL,待用 標準品A=陰性質控 標準品B=臨界質控 標準品C=弱陽性質控 標準品D=陽性質控 內含抗RSV的IgM抗體,PBS(磷酸緩沖液),穩定劑。 |
1×14ml |
酶標IgM |
紅色,待用。內含過氧酶標記的抗人IgM,蛋白緩沖液,穩定劑。 |
1×12×8 |
包被板 |
可拆,包被有特異性抗原。 |
1×14ml |
TMB底物液 |
含TMB |
1×14ml |
TMB終止液 |
0.5M的H2SO4 |
1×60ml |
稀釋液 |
含PBS緩沖液,<0.1%NaN3 |
1×60ml |
濃縮洗滌液 |
濃縮型(10×),含PBS緩沖液,吐溫20 |
2× |
粘性金屬板 |
用于在溫育時遮蓋包被板 |
1× |
塑料袋 |
用于儲存不用的板條 |
5、實驗所需材料但試劑盒不提供
1) RF吸附劑
2) 移液器,體積:5;50;100;500 μL
3) 校準儀
4) 樣品稀釋用試管(1ml)
5) 帶試劑儲器8道移液器
6) 洗滌瓶,自動或半自動洗板機
7) 能在450nm處讀數的酶標儀
8) 雙蒸水或去離子水
9) 吸水紙,取樣吸頭和計時器
6、實驗前的準備說明
6.1成分準備
稀釋/溶解 |
成分 |
|
稀釋液 |
比例 |
備注 |
貯存 |
穩定性 |
60ml |
洗滌液 |
加600ml |
雙蒸水 |
1:10 |
加熱至37°C以溶解 結晶,充分混合 |
2-8°C |
8周 |
6.2樣品稀釋
樣品 |
稀釋 |
稀釋液 |
比例 |
備注 |
血清/血漿 |
全部稀釋 |
稀釋緩沖液 |
1:101 |
例:5μL+500μL |
樣品中IgM濃度高于最高標準品的應當進一步稀釋。
6.3用RF吸附劑處理:
注意 |
為了避免特異性IgG和類風濕因子的干擾,病人的血清應當用RF吸附劑處理(RE59059)。 標準品和質控品千萬不要用RF吸附劑處理。 |
1. |
在400μL按1:101的比例稀釋的樣品中加入20μL RF吸附劑。充分混合。 |
2. |
室溫(18-25℃)下溫育≥1min(﹤15min) |
為了避免吸附特異性抗體,應當避免溫育時間﹥15min。
預處理的樣品可能會是渾濁的。
7、實驗步驟:
1) 加100μL標準品和已稀釋樣本于相應反應孔中,在定性檢測中只使用標準品B。
2) 封板后室溫(18℃-25℃)溫育60分鐘。
3) 移去粘性金屬板,棄去孔中液體。用300μL洗滌液洗板3次,在吸水紙上拍干。
4) 在每一微孔中加入100μL酶聯物。
5) 封板后室溫(18℃-25℃)溫育30分鐘。
6) 移去粘性金屬板,棄去孔中液體。用300μL洗滌液洗板3次,在吸水紙上拍干。加底物液和終止液時,如果有條件的話,可使用8孔微量移液器。確保底物液和終止液都是相同的時間間隔加入。使用確切容積并避免氣泡產生。
7) 每孔加TMB底物液100μL。
8) 室溫(18℃-25℃)避光溫育20分鐘。
9) 在每一微孔中加入100μLTMB終止液以終止底物反應。輕輕搖動包被板以使試劑混合均勻。此時,顏色藍色變成黃色。
10) 加終止液后60分鐘內在450nm處測OD值。
8、結果計算
在半對數坐標紙上或用自動生成的方法,以標準品的OD值為Y軸,濃度為X軸,繪制一標準曲線圖。用立體圖、4參數對 數圖或對數-對數圖都可獲得良好的實驗結果。對于標準曲線圖,用標準品的每一單值進行計算(樣品結果明顯異常的值必須刪除掉,應使用更加合理的單值)。樣 品的濃度可直接從標準曲線上獲得。一旦樣品稀釋了,就應當乘以相應的稀釋因子。如果樣品所測得的濃度高于最高標準,則應根據實驗前的準備說明所述對樣品進 行稀釋,并重新檢測。
9、結果判定: >12 U/ml 為陽性,8 - 12 U/ml 為可疑,< 8 U/ml 為陰性
此檢測結果并不是任何治療結果判定的唯一因素,它應當結合臨床觀察和診斷結果加以判斷。
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